葡聚糖蔗糖酶在食品级乳酸菌中重组表达
蒲元浩,彭凯歌,刘晓宇,孟庆泳,赵芳坤*,桑亚新*
【河北农业大学机构食品科技学院】
基金项目: 国家重点研发计划（2022YFD1600405）。
摘要
为研究葡聚糖在乳酸菌中的合成情况以及结构分析，本研究将葡聚糖蔗糖酶DsrB与带有SP45分泌信号肽的乳酸乳球菌表达载体pNZ8148质粒载体进行连接，电转入乳酸乳球菌NZ9000中进行异源表达。经由一系列醇沉、三氯乙酸去除蛋白质、二次醇沉、透析以及纯化等步骤得到多糖溶液。采用高效液相色谱法检测单糖组成；利用HPSEC测定葡聚糖的分子量；通过傅里叶红外技术、核磁共振技术以及扫描电镜分析多糖的结构并观察多糖表面特征。结果表明，将葡聚糖蔗糖酶在乳酸菌中进行表达，在蔗糖浓度为10%的条件下，葡聚糖产量为10.54 g/L；单糖组成显示仅含有葡萄糖一种单糖；胞外多糖分子量测定结果为2.4×106Da；由傅里叶红外和核磁联合表明体外合成的胞外多糖仅含有α-(1,6)糖苷键；扫描电镜表示胞外多糖表面呈现为多孔状结构。在乳酸菌中异源表达，实现了葡聚糖的食品级生产，为葡聚糖于食品中应用提供了理论基础。
葡聚糖，又称为右旋糖酐（Dextran），是一类具有支链葡萄糖的高聚物，主链由α-（1→6）糖苷键连接，支链由不同比例的α-（1→2）、α-（1→3）和α-（1→4）糖苷键连接形成。该类多糖因含有较高比例的α-（1→6）糖苷键而具有良好的水溶性，得到了广泛的应用。
葡聚糖蔗糖酶（Dextransucrase）属于GH70家族酶，主要由明串珠菌属和链球菌属等产生的，是一种胞外酶，依附于细胞壁上或者游离于培养基中。在传统意义上，GH70家族的酶仅被定义为葡聚糖蔗糖酶（DS），也被称为葡萄糖基转移酶（Gtfs），它们可以裂解蔗糖并聚合蔗糖衍生的D-葡萄糖部分合成具有不同大小、连接方式和支化程度的α-葡聚糖。还有一些GH70亚家族酶，例如4,6-α-葡聚糖转移酶（4,6-α-GTase）和4,3-α-葡聚糖转移酶（4,3-α-GTase）。
目前葡聚糖的生产利用的是在大肠杆菌体系中葡聚糖蔗糖酶催化进行体外合成或者是由菌株发酵生成，而未有利用乳酸菌体系来生产葡聚糖的。由葡聚糖蔗糖酶催化合成或由菌株生成的葡聚糖，可以在不同方面有所应用。比如高分子量葡聚糖可以应用于食品行业中当做乳化剂和增稠剂使用，还可以应用于化工行业中作为分子筛基质等。本研究的目的是利用乳酸菌体系催化合成高分子量葡聚糖，实现葡聚糖的食品级生产，更好的促进葡聚糖的应用。
本实验将来自柠檬明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶基因DsrB在乳酸乳球菌NZ9000中分泌表达，以蔗糖作为底物进行体外催化合成葡聚糖，以乳酸乳球菌作为宿主，以期实现葡聚糖的食品级生产，对乳酸菌中合成的葡聚糖的结构进行表征，为葡聚糖的食品级宿主生产提供理论支持。
材料与仪器
柠檬明串珠菌中葡聚糖蔗糖酶DsrB基因、乳酸乳球菌NZ9000、大肠杆菌MC1061、带有SP45分泌信号肽的pNZ8148质粒载体（前期构建）均为本实验室保存（均保存于−80 ℃冰箱）；Taq DNA高保真酶、DNA产物纯化试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒北京天根生化技术有限公司；限制性核酸内切酶：PstI、XbaI宝生物工程（大连）有限公司；Nisin（乳酸链球菌肽）、葡聚糖系列分子量标准品（T1000（1×106Da）、T500（5×105Da）、T300（3×105Da）、T100（1×105Da）、T70（7×104Da）、 T10（1×104Da））、MRS培养基、LB培养基分析纯，北京索莱宝生物科技有限公司；M17培养基分析纯，山东青岛奥博星生物技术有限公司；GM17培养基：以M17培养基为基础，加入2%葡萄糖；SGM17培养基：在GM17肉汤培养基的基础上加入10%的蔗糖。
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